Войти | Регистрация

Авторизация пользователя

Исследование молекулярно-генетической изменчивости горных козлов Кавказа (Capracaucasica, C. cylindricornis, C. aegagrus) и решение проблем таксономии

В настоящее время молекулярно-генетические методы изучения диких животных уже не экзотика.

Методы, основанные на анализе ДНК, широко используются для оценки генетического разнообразия, обусловливающего жизнеспособность видов и популяций, для выявления родственных связей между отдельными территориальными группировками животных, для уточнения таксономического статуса видов и внутривидовых структур.

Особенно востребованы эти методы для уточнения внутривидовой структуры, оценки реальности видов и подвидов животных, обитающих в малодоступных районах. Это в первую очередь относится к обитателям горных территорий. Даже у таких крупных видов как дикие бараны, козлы и некоторые другие виды диких копытных систематика до сих пор остается спорной. Сколько видов рода Ovis, например, в Евразии? Сколько подвидов включают отдельные виды? Ответы на эти вопросы имеют не только научное, но и важное практическое значение, для разработки действенной стратегии охраны и использования ресурсов этих видов. Описания внешнего вида, структуры рогов и других морфологических характеристик в ряде случаев недостаточно для ответы на эти вопросы. Наиболее объективные результаты дает объединенный анализ генетических и морфологических характеристик.

Клуб Горных Охотников взял на себя очень важную задачу – создать базу для серьезного изучения горных видов крупных млекопитающих. Экземпляры животных, добытых в малодоступных районах, становятся не только трофеями охотника.

При наличии фотографий, точного определения места добычи, взятии образцов для генетического анализа они становятся источниками научной информации. Существенное значение имеет долгосрочное сохранение образцов для генетического анализа – методы с каждым годом прогрессируют, по молекулярно-генетическим характеристикам с течением времени можно будет получить все больше и больше сведений.



Современная генетическая структура кавказских туров 
Capra caucasica и C. cylindricornis 
Н.В. Кашинина, М.В. Холодова

(Доклад на конференции "Актуальные вопросы современной зоологии и экологии животных". Посвящена 70-летнему юбилею кафедры "Зоология и экология" ПГУ и памяти профессора В.П. Денисова. 15-18 ноября 2016 года)

Систематика туров Кавказа до настоящего времени остается недостаточно ясной. Несмотря на разногласия, большинство ученых признают существование двух видов тура: западнокавказского, или кубанского, (C. caucasica) и восточнокавказского, или дагестанского (C. cylindricornis). Оба вида внесены в Красный список Международного союза охраны природы (IUCN). Для научно обоснованной охраны и рационального использования этих ценных охотничьих видов необходимо знать их генетическую структуру и разнообразие.

В данной работе на основе полиморфизма гена цитохрома b мтДНК (cyt b), наследуемого только по материнской линии, исследована современная генетическая структура туров на территории Кавказа. Нами были получены последовательности гена cyt b мтДНК (715 bp) для 11 образцов западнокавказского тура из Краснодарского края (1) и Карачаево-Черкесской республики(10) и 6 образцов восточнокавказского тура из республик Северная Осетия-Алания (4) и Дагестан (2), добытых в качестве трофеев членами клуба Горных охотников в течение охотничьего сезона 2014-2015 года. Кроме того, в анализ вошли последовательности того же гена, полученные нами для 3 туров из Карачаево-Черкессии и 5 из Карбардино-Балкарской республики, определенные охотниками как центральнокавказские туры, таксономический статус которых до конца не ясен. Были построены медианные сети гаплотипов, отражающие их филогенетические отношения.

Для C. caucasica описано 3 гаплотипа, выделено две гаплогруппы, генетически существенно удаленные друг от друга – генетическая дистанция между ними была 2,8%. В первую, наиболее распространенную, вошли все образцы из Карачаево-Черкесской республики, во вторую – один образец из Краснодарского края.

Для C. cylindriconis описано 6 гаплотипов, выделено три гаплогруппы. В первую вошли образцы из Дагестана, во вторую – из Кабардино-Балкарии и два образца из Северной Осетии. Генетическое различие между этими гаплогруппами составило 1,4%. Третья группа, значительно дистанцированная от этих двух гаплогрупп (3,2 и 3,1%), включала два образца туров из Северной Осетии.

По cyt b мтДНК центральнокавказские туры не сформировали отдельной группы. Часть образцов, относящихся к этой форме, имела гаплотипы, характерные для C. caucasica (3 образца из Карачаево-Черскесской республики), вторая часть (5 образцов из Кабардино-Балкарии) – к C. cylindriconis. Для выяснения статуса этой формы необходим углубленный анализ ядерной ДНК.

При объединении сиквенсов cyt b мтДНК исследованных видов мы получили интересную картину: образец C. caucasica из Краснодарского края оказался генетически близок к C. cylindriconis, а группа, включающая два образца из Северной Осетии, морфологически определенные как дагестанские туры, наоборот была близка к кубанским турам. При этом межвидовая дистанция составила 2,5%, а при исключении спорных образцов – 2,8%.

Наши данные подтверждают высказанные ранее предположения (Гептнер и др., 1961; Данилкин, 2005; Звычайная, 2008 и др.) о существовании межвидовой гибридизации между кавказскими турами, ареалы которых перекрываются. Вопрос о том, является ли интрогрессия чужеродной мтДНК результатом древней или современной межвидовой гибридизации, можно решить в последующих исследованиях с привлечением маркеров ядерной ДНК (фрагментов Y-хромосомы и микросателлитных локусов).

География сбора генетического материала членами КГО

Gen.mat copy

Стадии анализа генетического материала

Стадии анализа Пояснения Примечания
Выделение ДНК С использованием набора QIAGEN, включая все реактивы и пластик. Стадия выделения ДНК требуется для всех проб без исключения
Сиквенс включая все промежуточные стадии: ПЦР, очистка продукта, ПЦР с меченными флоуресцентной меткой нуклеотидами, капиллярный электрофорез. Размер получаемого фрагмента до 1000 н.п. На каждую пробу требуется по 2 прочтения (прямое и обратное) каждой из 3 последовательностей (1 митохондриального гена и 2 - ядерного), т.е. всего 6 прогонов. Получение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) требуется для всех новых проб
Фрагментный анализ микросателлитных локусов* Включая все промежуточные стадии: ПЦР с меченными праймерами, капиллярный электрофорез с размерным стандартом. Предполагается использование не менее 10-15 локусов. Для получения валидных результатов необходимо проведение 2х повторностей (итого: 20 реакций на образец). Проведение микросателлитного анализа планируется впервые для всех без исключения проб
* Дополнительных временных и финансовых расходов потребует пробный микросателлитный анализ, подбор праймеров и отработка методики фрагментного анализа, который будет проводиться впервые для данной таксономической группы

По вопросам отбора и анализа генетического материала можно обратиться к Гомонову Александру тел.: +7 (915) 135-76-35, e-mail: kgo.alexander@gmail.com

Инструкция по сбору генетического материала

ОТЧЕТ О РЕЗУЛЬТАТАХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ОБРАЗЦОВ ТКАНЕЙ ТРОФЕЕВ, ДОБЫТЫХ ЧЛЕНАМИ КЛУБА ГОРНЫХ ОХОТНИКОВ

Пояснения к таблицам
d-петля / цит. B - анализируемый фрагмент ДНК Кол-во п. н. (пар нуклеотидов) - длина анализируемого фрагмента ДНК
Определение вида по Blast NCBI GenBank: National Center for Biotechnology Information, NCBI - институт обработки и хранения данных молекулярной биологии, Blast - программа поиска локальных выравниваний, с ее помощью проводится сравнение анализируемых образцов с уже имеющимися в генетическом банке и определение вида
Номера, присвоенные в GenBank - номера, по которым можно найти образец (и всю имеющуюся по нему информацию) в базе данных Гомологичные последовательности из Ген.банка и % сходства (номера) - последовательности ДНК, с которыми оказались наиболее схожи исследуемые образцы (и процент сходства) (Ссылка на ген.банк https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Наверху есть строка для поиска).

 
Горные козлы
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства
3 Среднеазиатский козел 11.09.14 Республика Казахстан, Гранитогорское самец, 10+ Резник В.М.    *   884 Capra sibirica KT633870 99, AF034734.1
4 Среднеазиатский козел 14.09.14 Республика Казахстан, Гранитогорское самец, 10+ Резник В.М.      * 832 Capra sibirica KT246294 99, DQ246770.1
8 Гобийский козерог 07.09.14 Монголия, р-н Байхонгор, рядом с селом Жинст самец, 8-9 Бендерский Э.В.     * 816 Capra ibex KT246295 99, AB743826.1
9 Гобийский козерог 07.09.14 Монголия, р-н Байхонгор, рядом с селом Жинст самец Бендерский Э.В.     * 910 Capra ibex KT260194 99, AB743826.1
15 Козерог сибирский 11.10.14 Красноярский край, Ермакоский район самец 12+ Харитонов Е.В. "Сталкер групп"   * 941 Capra sibirica KT283242 99, DQ246775.1
25 Козерог сибирский 27.11.14 Киргизия, Иссыкульская обл., Джетогурский р-н самец Ким В.Н.     * 949 Capra sibirica KT633871 99, FJ207529.1
26 Козерог среднеазиатский 11.12.14 Казахстан, Меркенский р-н Жамбынской обл. о/х "Гранитогорское" 42`557 943 73`402 271 самец 11-12 Бендерский Э.В.     * 853 Capra sibirica KT283245 99, AF034734.1
28 Безоаровый козел 14.01.15 Турция, г. Нигде, Демирказык самец Резник В.М.      * 814 Capra hircus KT283248 99, KM093871.1
29 Асторский мархур 11.02.15 Пакистан, Sassi heramosh gilgi baltistan самец Резник В.М.      * 976 Capra falconeri KT283249 99, AB044309.1
30 Сулейманский мархур 01.02.15 Пакистан, Torghar Tanishpa district "Killa Saifullah" самец Резник В.М.      * 827 Capra falconeri KT283250 99, AB044309.1
31 Гибридный безоаровый козерог 02.04.15 Хорватия, остров Дуги Оток самец Бендерский Э.В.     * 834 Capra hircus KT283251 100, KM093871.1
41 Алтайский козерог 04.08.15 Кош-Агачский район, Горный Алтай, N 50` 4 4 E 86`56 6 самец 12 лет Резник В.М.      * 854 Capra sibirica KU165679 99, DQ246774.1
74 Козерог алтайский 06.11.15 Казахстан, Усть-Каменогорск, Катон-Карагайский природный парк, п.Зырянка, с.ш. 49.12.24.36, в.д. 86.35.56.10 самец 15 лет Бендерский Э.В.     * 999 Capra sibirica KX096851 99, DQ246779.1
75 Козерог джунгарский 09.11.15 Казахстан, Джунгарский Алатау самец 9 лет Бендерский Э.В.     * 1053 Capra sibirica KX096852 98, DQ246772.1
76 Козерог сибирский 17.10.15 Красноярский край, с.ш. 51.57.04.19, в.д.86.35.56.10 самец 12 лет Бендерский Э.В.     * 1002 Capra sibirica KX096853 99, DQ246775.1
82 Capra sibirica 11.11.15 Казахстан, Гранитогорский самец 13+ Харитонов Е.В.     * 1043 Capra sibirica KY366503 99,  DQ246770.1
83 Козел среднеазиатский 18.10.15 Киргизия, Иссыккульская обл., Кумтор самец 10+ Сталкер     * 1047 Capra sibirica KY366504 99, DQ246770.1
84 Козел среднеазиатский 18.10.15 Киргизия, Иссыккульская обл., Кумтор самец 11+ Сталкер     * 1069 Capra sibirica KY366505 99, DQ246770.1
90 Козерог Синд 20.10.15 Пакистан, Dureji, Balochistan самец 12 Алексеев А.Н.  Сталкер   * 1039 Capra aegagrus blythi KX910789 99, AB110592.1
91 Козерог Синд 18.10.15 Пакистан, Dureji, Balochistan самец Алексеев А.Н.  Сталкер   * 1039 Capra aegagrus blythi KX910790 99, AB110592.1
94 Capra sibirica 27.10.15 Таджикистан, Памир, хр. Южный Аличур самец 12+ Сталкер     * 952 Capra sibirica KX910792 99, DQ246799.1
106 Синдский безоаровый козел 03.03.16 Пакистан, Дуредши самец 12-13 лет Бендерский Э.В.     * 1097 Capra aegagrus blythi  KY366510 99, AB110592.1
116 Безоаровый козел 01.04.16 Армения, Ехеченадзор самец 8-9 лет Бендерский Э.В.     * 1082 Capra aegagrus KY366517 99, DQ514541.1
129 Гималайский горный козел   Пакистан самец       * 1095 Capra sibirica  KY366530 99,  DQ246799.1
150 Сибирский козерог 01.11.2016 Саяны самец Иджир, Иванов М.     * 855 Capra sibirica KY491664 99, DQ246775.1
160/267 Безоаровый козел 14.02.2017 Иран, г. Язд самец, 7 лет Бендерский Э.В.     * 1093 Capra aegagrus KY996520 99, KR059225.1
161/268 Сибирский горный козел (козерог) 01.12.2016 Таджикистан, Памир, Джарта Гумбез, ущелье Даньчи   Бендерский Э.В.     * 1113 Capra sibirica KY996521 100, DQ246799.1

Серна
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства 
12 Серна кавказская 27.09.14 Карачаево-Черкессия, Карачаевский район самец Алексеев А.Н.  "Сталкер групп" *   825 Rupicapra rupicapra KT260184 96, GQ291364.1
16 Серна кавказская 18.10.14 Карачаево-Черкессия, пос. Приэльбрусье самка 4+ Харитонов Е.В. "Сталкер групп" *   751 Rupicapra rupicapra KT246296 96, GQ291402.1
17 Серна кавказская 18.10.14 Карачаево-Черкессия, пос. Приэльбрусье самка 5+ Харитонов Е.В. "Сталкер групп" *   748 Rupicapra rupicapra KT260187 96, GQ291401.1
42 Серна кавказская 21.08.15 Карачаево-Черкессия самец Седов А.С.     * 966 Rupicapra rupicapra KU165680 99, AB050506.1
55 Серна кавказская 22.08.15 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский район самка       * 805 Rupicapra rupicapra KX096833 99, AB050506.1
68 Серна кавказская 26.09.15 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец 4+ Резник В.М.      * 1080 Rupicapra rupicapra KX096845 99, AB050506.1
69 Серна кавказская 26.09.15 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец 5+ Резник В.М.      * 960 Rupicapra rupicapra KX096846 99, AB050506.1
68 Серна кавказская 26.09.15 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец 4+ Резник В.М.      * 1080 Rupicapra rupicapra KX096845 99, AB050506.1
69 Серна кавказская 26.09.15 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец 5+ Резник В.М.      * 960 Rupicapra rupicapra KX096846 99, AB050506.1
73 Серна шартрезская 29.10.15 Франция, 50км к югу от Гренобля, дер. Gresse-en-Vercors самка 11 лет Бендерский Э.В.     * 1081 Rupicapra pyrenaica KX096850 99, KJ184174.1
81 Серна кавказская 19.09.15 КБР, п. Эльбрусский самец Петрушенко А.     * 1048 Rupicapra rupicapra KX096857 99, AB050506.1
85 Серна кавказская 25.09.15 Северная Осетия, Араухох самка       * 1050 Rupicapra rupicapra KX096858 99, AB050506.1
87 Серна кавказская 25.09.15 Северная Осетия, Араухох самец       * 1083 Rupicapra rupicapra KX096860 99, AB050506.1
151 Серна среднекавказская 03.11.16 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец Бендерский Э.В.     * 1113 Rupicapra rupicapra KY491665 99, AB050506.1

Горные бараны
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства
1 Konya Sheep 19.09.14 Турция, Кония, Bordag самец, 9+ Резник В.М.  "Сталкер групп"   * 847 Ovis orientalis anatolica KT260193 100, EU365974.1
2 Konya Sheep 19.09.14 Турция, Кония, Bordag самец, 9+ Резник В.М.  "Сталкер групп" *   753 Ovis orientalis anatolica KT633873 99, KF677267.1
10 Гобийский аргали 04.09.14 Монголия, пос. Хантабула N 43`04.767 E 108` 25.388 самец 12-13 Бендерский Э.В.   *   850 Ovis ammon darwini KT260182 98, AF242348.1
11 Гобийский аргали 04.09.14 Монголия, пос. Хантабула N 43`04.767 E 108` 25.388 самец 12-13 Бендерский Э.В.   *   812 Ovis ammon darwini KT260183 95, AF242348.1
13 Аргали Северцова 10.10.14 Узбекистан, N 47`12.111 E 106`01.374 самец 4 Резник В.М.    *   847 Ovis vignei bochariensis KT260185 97, AF039580.1
22 Баран Марко Поло 18.11.14 Таджикистан, Горно-Бадахшан, Рангкуль самец, 10+ Резник В.М.  "Сталкер групп" *   700 Ovis aries KT260190 96, KF677088.1
23 Тянь-Шаньский Аргали ? 08.11.14 Киргизия, Иссыкульский район самец, 10+ Резник В.М.  "Сталкер групп" *   811 Ovis ammon KT260191 96, HM236188.1
24 Карелини аргали 27.11.14 Киргизия, Иссыкульская обл., Джетогурский р-н самец Ким В.Н.   *   972 Ovis vignei bochariensis KT260192 97, AF039580.1
32 Европейский муфлон 03.04.15 Хорватия, остров Дуги Оток самец Бендерский Э.В.     * 784 Ovis orientalis KT283252 99, KF938360.1
34 Далматинский баран 04.04.15 Хорватия, остров Дуги Оток самец Бендерский Э.В.     * 705 Ovis aries  KT283254 96, AY879542.1
40 Ovis ammon darvini 02.07.15 Гоби, Монголия N 46`43 30, E 97`17`33` самец 9 лет Резник В.М.      * 965 Ovis ammon darwini KU165678 99, AJ867273.1 
44 Хангайский аргали 02.09.15 Монголия, N 45` 34 574 E 101` 26 492 самец 12 лет Бендерский Э.В.     * 916 Ovis ammon darwini KU165681 99, AF242350.1
77 Архар 09.11.15 Киргизия, Нарынская обл., участок Кечигет самец Максимов А.С.     * 1056 Ovis ammon KY366502 99, KT781689.1
89 Уриал Бланфорд 18.10.15 Пакистан, Dureji, Balochistan самец Алексеев А.Н.  Сталкер   * 1045 Ovis vignei KX910788 99, EU366042.1
92 Ovis ammon karelini 20.10.15 Киргизия, Иссыккульская обл., Кумтор самец 8+ Сталкер     * 1053 Ovis ammon sevetzovi KX910791 99, EU366057.1
97 Архар Марко поло 03.10.15 Таджикистан, озеро Каракуль самец Будин А.М.     * 1077 Ovis ammon KX910793 99, AF242349.1
98 Архар Марко поло 03.10.15 Таджикистан, озеро Каракуль самец Будин А.М.     * 1036 Ovis ammon KX910794 99, AF242349.1
102 муфлон Конья 16.01.16 Грузия GPS:38 00 33, 06 32 59 52,50 самец 5 лет Бендерский Э.В.     * 1038 Ovis aries KY366507 100, KU899150.1
103 муфлон Конья 16.01.16 Грузия GPS:38 00 33, 06 32 59 52,50 самец 8 лет Бендерский Э.В.     * 1059 Ovis aries KY366508 100, KU899150.1
105 Уриал Бланфорд 02.03.16 Пакистан, Дуредши самец Бендерский Э.В.     * 1092 Ovis vignei  KY366509 99, EU366046.1
118 Аргали Северцова 2016, октябрь Узбекистан, Нуратинский район самец 7-8 лет Бендерский Э.В.     * 1108 Ovis ammon KY366519 99, EU366057.1
147 Марко Поло Аргали 07.11.16 Таджикистан, Горно-Бадахшанская область, Мургабский район, Рангкуль самец Сталкер     * 854 Ovis ammon polii KY491661 99, AJ867267.1
148 Марко Поло Аргали 08.11.16 Таджикистан, Горно-Бадахшанская область, Мургабский район, Рангкуль самец Сталкер     * 846 Ovis ammon polii KY491662 99, AJ867267.1
149 Аргали Северцова 12.12.16 Узбекистан самец Сталкер     * 854 Ovis ammon sevetzovi KY491663 99, EU366057.1
153 Уриал бухарский 17.11.16 Таджикистан, Вахшский хребет, 38 54 441" 69 59 384" самец Бендерский Э.В.     * 852 Ovis vignei bochariensis KY491667 99, EU366042.1
154/259 Аргали Брукея 05.12.16 Таджикистан, 37 33 0051" 74 04 33 43" самец 9,5 лет Бендерский Э.В.     * 1104 Ovis ammon KY491668 99, AJ867267.1
159/262 Керманский баран 13.02.2017 Иран, г. Язд самец Бендерский Э.В.     * 1113 Ovis vignei KY996519 100, EU366022.1
      
Снежные бараны
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства
51 Корякский снежный баран 02.09.15 Камчатский край, Олюторский район самец       * 970 Ovis nivicola KU165684 99, AJ867263.1
52 Корякский снежный баран 02.09.15 Камчатский край, Олюторский район самец       * 1007 Ovis nivicola  KU165685 99, AJ867263.1
53 Охотский баран 2015 год Магаданская область самец       * 807 Ovis nivicola  KX096832 99, AJ867263.1
54 Корякский снежный баран 30.08.15 Камчатский край, Олюторский район самец       * 996 Ovis nivicola  KY366501 99, AJ867263.1
59 Баран снежный якутский 17.09.15 Хабаровский край, Охотский район, река Ниткан (Юдома) самец Резник В.М.      * 1098 Ovis nivicola KX096837 99, AJ867263.1
60 Баран снежный (охотский) 23.09.15 Хабаровский край, Охотский район, исток реки Унчи самец 12 лет Резник В.М.      * 1079 Ovis nivicola KX096838 99, AJ867263.1
119 Камчатский снежный баран 06.08.16 Камчатка, Тигиль самец       * 1113 Ovis nivicola  KY366520 99, AJ867263.1
120 Корякский снежный баран 07.08.16 Камчатка, Ветровоям самец       * 1071 Ovis nivicola  KY366521 99, AJ867263.1
121 Баран Далла 24.09.16 США, Аляска, Фербенкс самец Ким В.Н.     * 1102 Ovis dalli KY366522 99, EU365992.1
122 Камчатский снежный баран 17.08.16 Камчатка, Мильково, р. Китильгина самец Будин А.М.     * 1107 Ovis nivicola  KY366523 99, AJ867263.1
125 Камчатский снежный баран 07.08.16 Камчатка, Мильково самец 11 лет Петрушенко А.     * 1094 Ovis nivicola  KY366526 99, AJ867263.1
126 Корякский снежный баран 27.08.16 Камчатка, Тиличики самец 9 лет Петрушенко А.     * 1104 Ovis nivicola  KY366527 99, AJ867263.1
127 Чукотский снежный баран 23.08.16 Камчатка, Тиличики, р. Ваенга самец 10 лет Петрушенко А.     * 1116 Ovis nivicola  KY366528 99, AJ867263.1
128 Камчатский снежный баран 09.08.16 Ккмчатка, Мильковский район самец 11 лет Петрушенко А.     * 1101 Ovis nivicola  KY366529 99, AJ867263.1
130 Колымский снежный баран     самец       * 1113 Ovis nivicola  KY366531 99, AJ867263.1
131 Камчатский снежный баран   Камчатка самец       * 1111 Ovis nivicola  KY366532 99, AJ867263.1
132 Колымский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" Север Камчатки самец       * 1109 Ovis nivicola  KY366533 99, AJ867263.1
133 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 1091 Ovis nivicola  KY366534 99, AJ867263.1
134 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 1112 Ovis nivicola  KY366535 99, AJ867263.1
135 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 1033 Ovis nivicola  KY366536 99, AJ867263.1
136 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 1092 Ovis nivicola  KY366537 99, AJ867263.1
137 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 976 Ovis nivicola  KY366538 99, AJ867263.1
138 Корякский снежный баран   стык ареала с "Чукотским" самец       * 1101 Ovis nivicola  KY366539 99, AJ867263.1
140 Камчатский снежный баран 05.10.16 Камчатка самец 7 лет Петрушенко А.     * 1101 Ovis nivicola  KY366541 99, AJ867263.1
141 Камчатский снежный баран 05.10.16 Камчатка самец 10 лет Петрушенко А.     * 1113 Ovis nivicola  KY366542 99, AJ867263.1
146 Охотский снежный баран 13.08.16 Хабаровский край, Охотский район самец Ким В.Н.     * 1095 Ovis nivicola  KY366547 99, AJ867263.1

Туры
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства 
27 Кубанский тур 25.11.14 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский р-н, ущелье Аксаут, Река Марка самец Котенков Дмитрий Профихант   * 829 Capra caucasica KT283246 99, DQ246780.1
27" Кубанский тур 25.11.14 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский р-н, ущелье Аксаут, Река Марка самец Котенков Дмитрий Профихант   * 751 Capra caucasica KT283247 99, DQ246780.1
37 Тур среднекавказский 2015 год Карачаево-Черкессия N 43`334122, E 42`246573 самец Бендерский Э.В.     * 902 Capra caucasica KX096824 99, DQ246780.1
38 Тур среднекавказский 2015 год Карачаево-Черкессия N 43`334122, E 42`246574 самец Бендерский Э.В.     * 912 Capra caucasica KX096825 99, DQ246780.1
39 Тур среднекавказский 2015 год Карачаево-Черкессия N 43`334122, E 42`246575 самец Бендерский Э.В.     * 909 Capra caucasica KX096826 99, DQ246780.1
43 Тур кубанский 21.08.15 Соленовское ох. Хозяйство Краснодарский край самец 16 лет Седов А.С.     * 806 Capra caucasica KX096827 99, JN632609.1
45 Тур кубанский 02.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 9 лет Будин А.М.     * 970 Capra caucasica KX096828 99, DQ246780.1
46 Тур кубанский 02.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 13 лет Будин А.М.     * 916 Capra caucasica KX096829 99, DQ246780.1
47 Тур среднекавказский 19.08.15 Кабардино-Балкария, Чегемский район самец Будин А.М.     * 848 Capra cylindricornis KU165682 99, DQ246769.1
48 Тур кубанский 14.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 9 лет Будин А.М.     * 908 Capra caucasica KX096830 99, DQ246780.1
49 Тур кубанский 13.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 13 лет Будин А.М.     * 815 Capra caucasica KX096831 99, DQ246780.1
43 Тур кубанский 21.08.15 Соленовское ох. Хозяйство Краснодарский край самец 16 лет Седов А.С.     * 806 Capra caucasica KX096827 99, JN632609.1
45 Тур кубанский 02.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 9 лет Будин А.М.     * 970 Capra caucasica KX096828 99, DQ246780.1
46 Тур кубанский 02.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 13 лет Будин А.М.     * 916 Capra caucasica KX096829 99, DQ246780.1
47 Тур среднекавказский 19.08.15 Кабардино-Балкария, Чегемский район самец Будин А.М.     * 848 Capra cylindricornis KU165682 99, DQ246769.1
48 Тур кубанский 14.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 9 лет Будин А.М.     * 908 Capra caucasica KX096830 99, DQ246780.1
49 Тур кубанский 13.08.15 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец 13 лет Будин А.М.     * 815 Capra caucasica KX096831 99, DQ246780.1
56 Тур кубанский 22.08.15 Качарачаево-Черкессия, Зеленчукский район самец       * 1080 Capra caucasica KX096834 99, DQ246780.1
57 Тур кубанский 23.08.15 Качарачаево-Черкессия, Зеленчукский район самец       * 1008 Capra caucasica KX096835 99, DQ246780.1
58 Тур среднекавказский 01.09.15 Кабардино-Балкария, Приэльбрусский район Тырнауз самец       * 1086 Capra cylindricornis KX096836 100, DQ246769.1
61 Тур дагестанский 04.10.15 Дагестан, Рутульский район самец 9 лет Бендерский Э.В.     * 1084 Capra cylindricornis KX096839 99, DQ246776.1
62 Тур дагестанский 08.10.15 Дагестан, Рутульский район, район села Миких самка 3-4 года Бендерский Э.В.     * 1081 Capra cylindricornis KX096840 99, DQ246776.1
63 Тур дагестанский 18.09.15 Северная Осетия Верхний Фиагдон самец 6+ Резник В.М.      * 1017 Capra cylindricornis  KX096841 99, DQ514549.1 
64 Тур дагестанский 18.09.15 Северная Осетия Верхний Фиагдон самец 10+ Резник В.М.      * 1062 Capra cylindricornis KX096842 99, DQ514549.1
65 Тур кубанский 19.09.15 Карачаево-Черкессия, река Кубань самец 12+ Сталкер     * 1106 Capra caucasica KX096843 99, DQ246780.1
66 Тур кубанский 06.09.15 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский район самец 7 лет Сталкер     * 1099 Capra caucasica KX096844 99, DQ246780.1
78 Тур среднекавказский 06.10.15 Тырнаузский р-н, КБР самец Петрушенко А.     * 1051 Capra cylindricornis KX096854 100, DQ246769.1
79 Тур среднекавказский 13.09.15 Приэльбрусский р-н, КБР самец Максимов А.С. Нигретто Сервасио   * 1042 Capra cylindricornis KX096855 99, DQ246769.1
80 Тур среднекавказский 11.09.15 Приэльбрусский р-н, КБР самец Максимов А.С. Нигретто Сервасио   * 1043 Capra cylindricornis KX096856 100, DQ246769.1
86 Тур дагестанский 23.09.15 Северная Осетия, Камандарское ущелье самец       * 1090 Capra cylindricornis KX096859 100, DQ514543.1
88 Тур дагестанский 23.09.15 Северная Осетия самец       * 1055 Capra cylindricornis KX096861 99, DQ514543.1
86 Тур дагестанский 23.09.15 Северная Осетия, Камандарское ущелье самец       * 1090 Capra cylindricornis KX096859 100, DQ514543.1
88 Тур дагестанский 23.09.15 Северная Осетия самец       * 1055 Capra cylindricornis KX096861 99, DQ514543.1
99 Тур срезнекавказский   Карачаево-Черкессия, с.ш. 432054,30, в.д. 421412,95 самец молодой Бендерский Э.В.     * 1089 Capra caucasica KX910795 99, DQ246780.1
100 Тур среднекавказский   Карачаево-Черкессия, с.ш. 432054,30, в.д. 421412,95 самка Бендерский Э.В.     * 1039 Capra caucasica KX910796 99, DQ246780.1
101 Тур среднекавказский   Карачаево-Черкессия, с.ш. 432054,30, в.д. 421412,95 самка Бендерский Э.В.     * 1089 Capra caucasica KX910797 99, DQ246780.1
112 Дагестанский тур 05.06.16 Азербайджан, Щекинский район, Филь-Фили самец Maclovio Hernandez     * 1107 Capra cylindricornis KY366515 99, DQ246776.1
115 Дагестанский тур   Карачаево-Черкессия самец 11 лет Бендерский Э.В.     * 1088 Capra caucasica KY366516 99, KX096844.1
117 Дагестанский тур   Карачаево-Черкессия самец 12 лет Бендерский Э.В.     * 1041 Capra caucasica KY366518 99, KX096844.1
123 Кубанский тур 23.08.16 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский район, ущелье Аксаут самец 7 лет Максимов А.С.     * 851 Capra caucasica KY366524 100, KX096843.1
124 Кубанский тур 23.08.16 Карачаево-Черкессия, Зеленчукский район, ущелье Аксаут самец 9 лет Максимов А.С.     * 1092 Capra caucasica KY366525 99, KX096844.1
139 Дагестанский тур 17.09.16 Северная Осетия самец 11 лет Петрушенко А.     * 1094 Capra cylindricornis KY366540 99, DQ514543.1
142 Среднекавказский тур 31.08.16 Кабардино-Балкария, ущелье Черем самец Будин А.М.     * 1107 Capra cylindricornis KY366543 100, DQ246769.1
143 Среднекавказский тур 31.08.16 Кабардино-Балкария, ущелье Черем самец Будин А.М.     * 1094 Capra cylindricornis KY366544 99, DQ246769.1
144 Среднекавказский тур     самец       * 1113 Capra cylindricornis KY366545 100, DQ246769.1
145 Кубанский тур 25.08.16 Карачаево-Черкессия, ущелье Аксаут самец Будин А.М.     * 1116 Capra caucasica KY366546 100, KX096844.1
152 Тур дагестанский 03.11.16 Северная Осетия, Кармадонское ущелье самец Седов А.С.     * 846 Capra cylindricornis KY491666 100, DQ514549.1
156/233 Дагестанский тур   Северная Осетия, Г.Владикавказ, ФГБХ Североосетинское ГООХ,
Пригородный район, Урочище Жари-Ухох
  Волочкович     * 716 Capra cylindricornis KY996517 99, DQ514543.1
157/238 Кубанский тур 07.11.2016 Карачаево-Черкессия, Санчарский перевал, выше отметки на 500м, N43`27.716` E40`57.787`, 2.200нум.   Пузанкевич С. М.     * 1037 Capra caucasica KY996518 99, KX096844.1
              
Другие трофеи членов Клуба Горных Охотников
№ пробы Вид животного Дата отстрела Место добычи Пол/возраст ФИО охотника Примечания d-петля цит. B Кол-во н.п. Определение вида по Blast NCBI GenBank Номера, присвоенные в GenBank Гомологичные последовательности из NCBI GenBank и % сходства 
5 Марал монгольский 09.09.14 N 47`12.454 E 105`41.250 самец Бендерский Э.В.   *   911 Cervus elaphus KT633872 100, KF153100.1
6 Газель Гойда 09.09.14 N 47`12.098 E 106`01.358  47.2016 N 106.0226 E самец Бендерский Э.В.   *   920 Procapra gutturosa KT260180 98, GU386355.1
7 Газель Гойда 09.09.14 N 47`12.098 E 106`01.358 самец, 8-9 Бендерский Э.В.   *   728 Procapra gutturosa KT260181 99, DQ266303.1
14 Косуля сибирская  02.10.14 Красноярский край, Ермакоский район самец 5+ Харитонов Е.В. "Сталкер групп" *   863 Capreolus pygargus KT260186 99, JQ906173.1
18 Голубой баран 03.11.14 Непал, Дорпатан самец 10-11 Бендерский Э.В.   *   791 Pseudois nayaur KT260188 91, EF420241.1
19 Голубой баран 03.11.14 Непал, Дорпатан самец 10-11 Молчанов А.В.    *   592 Pseudois nayaur KT260189 90, EF420241.1
20 Гималайский тар 08.11.14 Непал, Дорпатан самец Бендерский Э.В.     * 920 Hemitragus jemlahicus KT283243 99, FJ207531.1
21 Гималайский тар 08.11.14 Непал, Дорпатан самец Молчанов А.В.      * 954 Hemitragus jemlahicus KT283244 99, FJ207531.1
33 Гибридный кри-кри 03.04.15 Хорватия, остров Дуги Оток самец Бендерский Э.В.     * 863 Capra hircus KT283253 99, KM093871.1
50 Баран гривистый июль.15 Испания, Регион Эсмадура, деревня Навальвилар де пелеЮ, территория Мато Лозано самец 4 года Бендерский Э.В.     * 965 Ammotragus lervia KU165683 99, EF466060.1
70 Сибирская косуля 20.09.15 Западные Саяны, верховья Енисея самка Бендерский Э.В.     * 922 Capreolus pygargus KX096847 99, JX428937.1
71 Сибирская косуля 20.09.15 Западные Саяны, верховья Енисея самка Бендерский Э.В.     * 990 Capreolus pygargus KX096848 99, JQ958990.1
72 Марал 12.11.15 Казахстан, Алма-Атинская обл., Уйгурский р-н, ущелье Б.Дехкан самец Ким А.Р.     * 1007 Cervus elaphus KX096849 100, AY044856.1
96 Козерог кри-кри 10.12.15 Греция, остров Сапьенза самец 12 Бендерский Э.В.     * 1014 Capra hircus KY366506 100, KR866125.1
107 Gelada baboon 11.01.16 Эфиопия. Debre Libanos самец взр. Попов К.А.     * 1113 Theropithecus gelada KY366511 99, KC757412.1
108 Mountain Nyala 04.01.16 Эфиопия самец 11 лет Попов К.А.     * 1103 Tragelaphus buxtoni KY366512 99, AY667215.1
109 Menelik bush buck 03.01.16 Эфиопия самец 7-8 лет Попов К.А.     * 1106 Tragelaphus scriptus KY366513 96, JN632707.1
111 Abyssinian Greater Kudu 10.01.16 Эфиопия, Alutu hunting area самец 10-12 лет Попов К.А.     * 1096 Tragelaphus strepsiceros KY366514 94, AF022063.1
113 Coastal Black Bear  09.05.16 USA, Alaska/Juneau самец 6-7 лет Попов К.А.   *   480 Ursus americanus   99, HE657198.1
114 Coastal Black Bear  13.05.16 USA, Alaska/Gold Bay самец 8-10 лет Попов К.А.   *   472 Ursus arctos   100, HG426390.1

По современным представлениям на Кавказе обитает три вида, принадлежащих к роду Capra: западнокавказский (C. caucasica), восточнокавказский (C. cylindricornis) и безоаровый козел (C. aegagrus). В то время как видовая самостоятельность безоарового козла сомнению не подвергается, таксономический статус западно- и восточнокавказского козлов до сих пор вызывает оживленные дискуссии. Одни исследователи выделяют на Кавказе два самостоятельных вида – C. caucasica и C. cylindricornis (Цалкин, 1955; Верещагин, 1959; Гептнер и др., 1961; Schaller, 1977; Соколов В.Е., 1979; Павлинов и др., 1995), другие признают один – C. caucasica (Соколов, 1959; Громов и др., 1963; Темботов, 1974; Абдурахманов, 1977; Барышников и др., 1981; Айунц, 1992; Соколов, Темботов, 1993), третьи – три, четыре и  даже пять видов (Matschie, 1900; Разевиг, 1904; Динник, 1910). Кавказских козлов включали, кроме того, в состав сборного вида «ibex» (Schwarz, 1935; Haltenorth, 1963) или относили к C. ibex только западнокавказскую форму (Ellerman, Morrison-Scott, 1951). Существующая противоречивая таксономия кавказских козлов базируется, главным образом, на морфометрических исследованиях. В наших работах (Звычайная и др. 2007; Звычайная 2011а и др.) рассматриваются возможные сценарии происхождения и формирования разнообразия группы также на основании сопоставления молекулярно-генетических, морфологических и палеонтологических данных.
Предварительные молекулярно-генетические исследования. В качестве маркёров при проведении предварительного филогенетического анализа рода Capra мы использовали ген цитохрома b мтДНК и два фрагмента интрона гена SRY, локализованного в Y-хромосоме. Ген цитохрома b отражает изменения, происходящие по материнской линии наследования, ген SRY - отцовской. Всего получена 61 последовательность гена цитохрома b мтДНК Capra (из них 33 для животных из интересующего нас региона), и 63 (32) – гена SRY. Кроме того, в анализ были включены нуклеотидные последовательности соответствующих фрагментов из международной базы данных GenBank.
По результатам исследования мтДНК кавказские козлы не являются монофилетической группой. Их выборка представлена как минимум двумя ветвями: особи из Карачаево-Черкесии (9 образцов) и Северной Осетии (2) отличаются от экземпляров из Кабардино-Балкарии (5) и Азербайджана (4). Положение C. aegagrus на медианной сети гаплотипов в целом не устойчиво, что объясняется наличием 4-х разных митохондриальных линий. Выявлена большая генетическая дистанция между всеми линиями C. aegagrus и гомология последовательностей C. aegagrus с последовательностями других видов. Две гаплогруппы гомологичны двум группам кавказских горных козлов, третья объединяется с ветвью домашних коз и лишь одна гаплогруппа стоит особняком, обнаруживая отдалённое сходство с винторогим козлом.
Анализ фрагмента гена SRY показал низкий уровень изменчивости группы кавказских козлов, которая включает две ветви, представленные всего 1-2 гаплотипами. Одну из них формируют 18 образцов с Западного и Центрального Кавказа (из Карачаево-Черкесии и Кабардино-Балкарии), вторая представлена 7 образцами с Центрального и Восточного Кавказа (из Кабардино-Балкарии, Северной Осетии и Азербайджана). Таким образом, 8 зверей (из Кабардино-Балкарии и Северной Осетии) имеют смешанный генотип. Последовательности исследованного гена Y-хромосомы C. aegagrus единообразны, видоспецифичны, наибольшее сходство имеют с последовательностями C. hircus и C. falconeri.
Традиционно признается, что формирование видов C. caucasica и C. cylindricornis происходило на Кавказе. Однако остается не ясным, почему восточнокавказский козёл быстро специализировался и приобрёл яркое морфологическое своеобразие, тогда как западнокавказский сохранил «примитивный» облик и сходство с C. sibirica, C. nubiana и C. ibex. Неизвестными остаются также причины и механизмы, обеспечившие изоляцию двух форм козлов на относительно небольшой территории Кавказа.
С генетической точки зрения, эволюция рассматриваемой группы рода Capra может быть представлена так: относительно независимое происхождение западно- и восточнокавказского козлов, расширение (изменение) и наложение их ареалов и последующая гибридизация, которая, возможно, со временем могла бы привести к объединению генотипов разных популяций в единый генофонд и полному стиранию морфологических различий между видами, что уже имеет место на Центральном Кавказе.
Полиморфизм митохондриальных линий безоарового козла и их близкая гомология с линиями C. caucasica и C. cylindricornis, по всей видимости, объясняется гибридизацией этих видов и интрогрессией мтДНК. Современный ареал C. aegagrus на Кавказе мелкоочаговый и ограничивается территорией Дагестана, Чечено-Ингушетии, Азербайджана, Армении и Грузии. Однако, ранее безоаровый козёл был повсеместно распространён на Главном Кавказском хребте от Военно-Грузинской дороги (возможно, от бассейна Кубани) до восточных склонов, примыкающих к Каспийскому морю, а также в центральной и восточной части Малого Кавказа (Верещагин, 1949, 1959; Гептнер и др., 1961; Барышников, 1978). Ископаемых остатков C. aegagrus плейстоценового возраста на Большом Кавказе не обнаружено, что свидетельствует о его недавнем появлении на этой территории. Заселение Главного Кавказского хребта, происходило, видимо, из Передней Азии через Центральный Кавказ. В это же время, видимо, имела место и гибридизация с кавказскими козлами, что подтверждается большим сходством последовательностей гена цитохрома b C. aegagrus с последовательностями C. caucasica и C. cylindricornis из Карачаево-Черкесии и Кабардино-Балкарии соответственно.

Цели и задачи данной программы. Выявленные генетические дистанции между митохондриальными и ядерными линиями C. caucasica и C. cylindricornis весьма существенны. На этом основании сделано предположение, что существующая клинальная морфологическая изменчивость кавказских козлов объясняется вторичной гибридизацией исходно различных форм. Совершенно закономерно, что полученные результаты обозначили ряд вопросов, требующих дальнейшего рассмотрения. К таким вопросам относятся: уровень молекулярно-генетической дивергенции видов (C. caucasica, C. cylindricornis, C. aegagrus) и степень их генетической изолированности, а также интенсивность генного обмена между популяциями западно- и восточнокавказского горных козлов. Разрешение данных вопросов возможно после проведения анализа расширенной выборки образцов, а также фрагментного анализа микросателлитных локусов, который позволит провести границы между видами (формами), оценить уровень их дифференциации, выявить гибридов, определить ширину гибридной зоны. Микросателлитный анализ данной таксономической группы ранее не проводился, поэтому потребуется предварительный поиск маркеров и отработка методики, что также входит в программу исследования.

Цель исследования:
Оценить молекулярно-генетическое разнообразие популяций горных козлов на Кавказе (Capra caucasica, C. cylindricornis, C. aegagrus), приблизиться к решению проблем филогении и таксономии данных групп.

Задачи:
  • Расширить выборку образцов (на сегодняшний день уже собрана уникальная коллекция образцов для сравнительного ДНК-анализа исследуемых видов: всего около 90 образцов горных козлов Capra, из них 33 образца - с Кавказа.
  • Получить нуклеотидные последовательности гена цитохрома b мтДНК для всех новых образцов.
  • Получить нуклеотидные последовательности интрона гена SRY яДНК для всех новых образцов.
  • Осуществить подбор маркеров и отработку методики исследования изменчивости микросателлитных локусов яДНК козлов Кавказа. Провести микросателлитный анализ всей выборки образцов.
  • На основании полученных результатов дать оценку генетического разнообразия популяций, уровня молекулярно-генетической дивергенции, степени изолированности двух форм, а также интенсивности генного обмена между популяциями западно- и восточнокавказского горных козлов.
  • сравнить результаты анализа морфологической и молекулярно-генетической изменчивости Сapra, определить таксономический статус существующих форм Capra на Кавказе, границы их распространения, выявить область гибридизации.

Методы решения задач научного исследования:
Основой исследования станут стандартные молекулярно-генетические методы. Исследование будет проводиться на базе Кабинета методов молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН. Кабинет оснащен всем необходимым оборудованием, которое позволяет проводить выделение ДНК, ПЦР, прямое определение состава нуклеотидных последовательностей - секвенирование, а также генотипирование организма на основе
Материалом для данного исследования послужат образцы тканей горных козлов из разных частей их ареалов, находящиеся в коллекции кабинета методов молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН и из дополнительных сборов. Для анализа митохондриальной ДНК выбраны 2 фрагмента: контрольный регион и ген цитохрома b. В качестве ядерного маркера используется интрон гена SRY. Впервые для данной таксономической группы планируется проведение фрагментного анализа микросателлитных локусов.
Тотальная ДНК выделяется из заспиртованных образцов тканей, с использованием наборов реактивов «Diatom DNA Prep 200» («Изоген», Москва). Амплификация проводится в 10 мкл с использованием 2 мкл готовой пцр-смеси («Диалат», Москва), 1-2 мкл полученного раствора ДНК, 1 мкл прямого праймера (5 pmol/mkl), 1 мкл обратного праймера (5 pmol/mkl), с добавлением SmartTAQ полимеразы («Диалат», Москва). Для амплификации контрольного региона используются праймеры SaiF и SaiR, гена цитохрома b – праймеры GLU 5`-CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3`и R15915 5`-GGA ATT CAT CTC TCC GGT TTA CAA GAC-3` (Ozawa et al, 1997) и др. Полимеразная цепная реакция осуществляется при помощи амплификатора «Tetrad2» (BIO-RAD). при следующих условиях: 94°С – 3 мин (1 цикл); 94°С – 30 сек, 56°С – 30 сек, 72°С – 2 мин (35 циклов); 72°С – 10 мин (1 цикл). Фрагменты локализованного в Y-хромосоме гена SRY получаем, используя оригинальные праймеры: SRYL1 (5` – GCA TGT AGC TCC AGA ATA TTT CAC T – 3`), SRYH1 (5` – ATA AAT C(T/C)(G/A) T(G/A)A GGC AAA CTT GAA A – 3`), SRYL2 (5` – TGC TTC TGC TAT GTT CAG AGT ATT G – 3`) и SRYH3 (5` – GCA ATT TAC AAA GAG GTG GAA AGT A – 3`). Очистка продукта амплификации проводится методом осаждения раствором этилового спирта с добавлением 5М ацетата натрия. Электрофорез и чтение нуклеотидных последовательностей продукта амплификации выполняется на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems) с использованием набора реактивов BigDye Terminator kit 3.1 (Applied Biosystems).
При фрагментном анализе используются преимущественно микросателлитные локусы, содержащие динуклеотидные повторы (CA)n/(GT)n/(CT)n/(GA)n. Для каждой пары один олигонуклеотид (прямой) модифицируется флуоресцентной меткой. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводится в 10 мкл с использованием 1 мкл готовой пцр-смеси («Диалат», Москва), 1-2 мкл полученного раствора ДНК, 1 мкл прямого праймера, меченного флуоресцентной меткой (5 pmol/mkl), 1 мкл обратного праймера (5 pmol/mkl), с добавлением SmartTAQ полимеразы («Диалат», Москва). Амплификация осуществляется при следующих условиях: 95°С – 15 сек, 55°С – 15 сек, 72°С – 30 сек (40 циклов); 72°С – 30 мин (1 цикл). Электрофорез и определение длин продуктов амплификации проводится на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems), в качестве размерного стандарта используется LIZ500.
Обработка полученных данных проводится с использованием современного программного обеспечения. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляется вручную с помощью программы Bioedit (Hall, 1999). Исследование вариабельности последовательностей, оценка нуклеотидного разнообразия (внутривидовые дистанции ), вычисление межвидовых дистанций (Net distance) и построение филогенетических деревьев методом ближайшего связывания (Neighbor-Joining) осуществляется с использованием двухпараметрической модели Кимуры в программе MEGA 3.1 (Kimura, 1980; Saitou, Nei, 1987; Kumar et al., 2004). Генетическая дистанция между группировками (Net distance) вычисляется по алгоритму D = dXY – (dX - dY)/2, где  dXY – средняя генетическая дистанция между гаплотипами группировок  X и Y, а dX, dY – средняя дистанция между гаплотипами в пределах этих группировок. Построение медианных сетей гаплотипов выполняется в программе Network (Bandelt et al., 1999).
Ожидаемые результаты научного исследования. Заявленное исследование призвано восполнить пробел в наших знаниях о генетическом разнообразии популяций Capra (особенно C. caucasica, C. cylindricornis, C. aegagrus). Полученные результаты позволят уточнить таксономический статус исследуемых форм, реконструировать естественную историю формирования современных видов и оценить степень их дивергенции и изолированности в историческое время, интенсивность генного обмена, а также степень антропогенного влияния на генетическую структуру популяций. Кроме того, полученные данные должны расширить наши представления о роли гибридизации и процесса интрогрессии митохондриального генома в становлении генетического разнообразия этих видов копытных.